【組織培養(yǎng)試劑】

一般提示：優(yōu)化您的細胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并經(jīng)可能減少所用試劑的變更。

基礎培養(yǎng)基—目前所使用的各種市售培養(yǎng)基(如，RPMI 1640和DMEM   )。培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸，葡萄糖)，維生素，無機鹽，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果不在使用時新鮮加入就可能會產(chǎn)生問題。務必要使培養(yǎng)基避光保存。因為已知有一些組分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)。

酚紅試劑可保護細胞免受一些HEPES降解所產(chǎn)生的毒性效應，但在使用未加酚紅試劑的培養(yǎng)基的應用場合下，如熒光素酶的測定，細胞毒性則仍然是一個問題。

胎牛血清—血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長促進因子和生長抑制因子的極為復雜的混和物。采集血清所用動物的年齡、營養(yǎng)水平、和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量。因此血清易受顯著生物學變異的影響。

添加劑—某些細胞的生長依賴于一些對生命力或細胞分裂  必不可少的物質(zhì)(如，生長因子，微量元素，必需代謝物和蛋白等)。

CO2培養(yǎng)箱—細胞生長所需環(huán)境為37℃、相對濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值。細胞生理對pH的變化非常敏感，因此多數(shù)細胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2 濃度為5%來有效控制pH值，而另一些則需要10%的CO2。需要向您的培養(yǎng)基供應者核對一下適當?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致(溫度、濕度和CO2)則會導致實驗結果的板間變異性。來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學物質(zhì)，或真菌/細胞的污染也都可能影響到細胞生理 【細胞】

一般提示：密切觀察您的細胞;確保它們狀態(tài)良好。在開始轉染細胞之前，先制定一個適當?shù)姆N板方案，使細胞密度從轉染開始到結束都保持最佳狀態(tài)。

增加成功幾率—細胞是轉染過程中的一個關鍵元素，它可以是影響結果的一致性和質(zhì)量的最重要的變量。為幫助解決這些問題，羅氏應用科學部與ATCC?(美國菌種保藏中心)進行了合作。

為保證將被轉染細胞的質(zhì)量，羅氏應用科學部建議使用新近從ATCC?獲得的細胞系。

分裂細胞相比較非分裂細胞—分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數(shù)轉染操作而言，細胞都在轉染當天或前一天種板。同樣重要的是細胞在種板進行轉染時不應處于生長過度的狀態(tài)。由于FuGENE? 6和HD轉染試劑對于細胞作用溫和，可同時進行貼壁細胞的種板和轉染。

此外，還常用促有絲分裂刺激物(如，病毒轉化，生長因子，條件培養(yǎng)基，以及滋養(yǎng)細胞)來活化原代培養(yǎng)細胞。

貼壁細胞相比較懸浮細胞—在轉染效率方面貼壁細胞和懸浮細胞之間的差異顯著。天生趨于懸浮的細胞(如HL 60，Jurkat)非常難以轉染。相反，天生為貼壁的細胞(如HEK，CHO)則可適應懸浮生長的條件。

這兩種細胞(即那些天然懸浮的和那些適應懸浮的細胞)的漿膜是不一樣的。據(jù)推測轉染過程中的一個限制步驟就是通過內(nèi)吞作用攝取轉染分子(DNA或RNA與轉染試劑的復合物);然而，目前對此尚未有分子水平上的合理機制的解釋。

細胞間膜結構的差異可能是某些細胞類型天生難以轉染的部分原因。所以，尋找更有效轉染試劑的工作目前還主要是經(jīng)驗性的，尤其對于那些天生為懸浮的細胞而言更是如此。

這常常是在不含血清而含有抑制轉染的特殊添加劑的培養(yǎng)基中發(fā)生。經(jīng)小心處理后，這些細胞可適應于在沒有添加劑的環(huán)境中懸浮生長。如果這些適應于懸浮生長的貼壁細胞在沒有這些添加劑的環(huán)境中生長，那么它們就可以被轉染。

分批方案—在對培養(yǎng)細胞進行分批傳代培養(yǎng)之前，必須把貼壁細胞用胰蛋白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個常規(guī)操作可導致正常細胞功能受到嚴重損害。因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化時間的延長，胰蛋白酶的失活，以及消化后直到轉染開始的時間)都可能對轉染實驗有所影響。

如果在轉染時細胞過于密集，那么種到培養(yǎng)板上的就會是細胞團塊而非單個細胞。

對于某些細胞/試劑組合而言，漿膜狀態(tài)被改變后有可能會影響到所用試劑和DNA的最佳配用量和配比。

傳代次數(shù)—傳代次數(shù)是指對一個細胞系進行分批傳代的頻度(通常在一個實驗室范圍內(nèi))。在某些情況下，自建立細胞系起的確切傳代次數(shù)無法得知。

某些細胞系相比較其他細胞系而言較不穩(wěn)定，可能會隨著培養(yǎng)時間的延長而改變，視不同的細胞系和培養(yǎng)條件而定。培養(yǎng)條件的不同可引起克隆選擇。因此名稱相同的同一細胞系有關其生理學和形態(tài)學(以及轉染能力)性質(zhì)可能會有很大的差異。

一般而言，細胞在凍存復蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復蘇之前都很難轉染。在不同細胞系之間轉染效率的變化很大。某些細胞系在傳代很大次后仍能保持穩(wěn)定的轉染效率，而其他一些則傳代很少次數(shù)就表現(xiàn)出轉染效率的差異。

細胞數(shù)量(匯聚度)—只要培養(yǎng)基質(zhì)(組織培養(yǎng)皿)尚有空間，細胞就會按指數(shù)規(guī)律分裂。對于正常細胞而言，細胞生長的速度受細胞密度大小的抑制(接觸抑制)，但癌細胞則不受此限制而會繼續(xù)生長并可互相疊加。

營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細胞生長。細胞會因受到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉染。

報告基因的表達率與轉染開始時的細胞數(shù)量和細胞健康以及它們隨后直到細胞溶解之前的生長情況相關。

培養(yǎng)物污染—培養(yǎng)物可被細菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細胞種類所污染。各種污染都會導致產(chǎn)生錯誤的結果。

支原體污染—支原體污染在所有培養(yǎng)細胞中的比例為5-35%，它可改變細胞生長特性，酶的作用途徑，細胞膜的組成，染色體結構，以及轉染效率。特別是，支原體對采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導的轉染技術有所干擾，其結果致使轉染效率偏低或非典型。這些效應會導致實驗結果的不可靠以及時間和珍貴細胞系的損失。

和細菌及真菌不同，支原體污染無法通過視覺檢查發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過大多數(shù)的無菌濾膜;它們還對常用抗生素有抗藥性。所以必需進行支原體污染的常規(guī)篩查。

羅氏應用科學部提供支原體檢測試劑盒以幫助盡早發(fā)現(xiàn)支原體污染。

交叉污染—如果同一個實驗室同時培養(yǎng)不同種類的細胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。眾所周知有許多細胞系被HeLa細胞所污染。和其他細胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長快速的細胞摻入到培養(yǎng)細胞種，幾個月過后它們就會完全取代目標培養(yǎng)物。這種變化是逐漸發(fā)生的;而您可能甚至還未發(fā)現(xiàn)。

建立細胞系鑒定的檢測標準。例如，對于人類細胞系而言，STR(短串聯(lián)重復序列)圖譜就是一種可靠的鑒定方法。或者更簡單的解決方案就是，當懷疑有交叉污染時，如果有可能，就換用新鮮的，傳代次數(shù)少的細胞源。

【載體DNA】

一般提示：對您純化所得的載體進行質(zhì)量檢查。確定支持其正常功能的基因序列是否適合于您的細胞體系。在對您細胞體系的參數(shù)進行測定時，一定要選用一種您已知具有功能的對照載體。

載體的完整性—種載體是否具有功能取決于它結構的完整性。轉染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結構和舒展結構之間比例、雙螺旋中斷、核酸酶的降解，以及來自于儲存和處理過程中的物理壓力的影響。

載體制備物-各種載體是按照不同的方案在細菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物(如CsCl，內(nèi)毒素)可能會影響轉染效率。

載體構造(啟動子/增強子/ORI)—轉染體系通常用帶有強病毒調(diào)節(jié)元件(如，RSV，CMV，和 SV40)的對照載體進行優(yōu)化和比較。然而，病毒啟動子/增強子體系的相對有效性在不同細胞系間的差異可大到兩個數(shù)量級。例如，在某些細胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴增，SV40體系可高效表達 large T抗原(如，COS);而在其他許多細胞系中，則是CMV啟動子更為有效。

除此之外，各種CMV載體的表達率也會有超過一個數(shù)量級的差異，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的。

【轉染方案】

一般提示：建立一套適當?shù)霓D染方案;首先從一種標準方案開始，然后通過改變試劑/DNA的配比和形成復合物的數(shù)量進行優(yōu)化。

轉染復合物的制備—諸如轉染試劑/DNA配比，離子強度，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會影響到轉染復合物的組成和功能。質(zhì)粒既可在無菌水又可在TE緩沖液中稀釋。如果您要使用一種市售的轉染試劑，就應當仔細閱讀該試劑所提供的使用說明。需要對試劑提供方給予一定的信賴;除非您有很好的理由支持您做出改變，否則就應當嚴格按照他們所推薦的轉染方案。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉染復合物;如果制備復合物所使用的培養(yǎng)基含有血清，它就會對轉染產(chǎn)生抑制。

制備轉染復合物的最佳孵育時間是一個非常關鍵的環(huán)節(jié)，對于不同的轉染試劑而言可能差別很大。

轉染試劑/DNA配比(負載比)—所有的轉染試劑都會在某一個試劑/DNA配比時最為有效。有時候這種最佳配比的所在范圍非常狹窄;而且對于每種實驗體系都必須進行優(yōu)化才能得到最佳配比。為了尋找這種最佳配比往往會花費大量的時間和金錢。

除了配比的重要性之外，所加入轉染復合物量的多少也非常關鍵。

形成轉染復合物所用的稀釋劑—對于多數(shù)試劑而言，很關鍵的一點是要使轉染復合物能在普通基礎培養(yǎng)基和鹽溶液中形成。

FuGENE? HD 轉染試劑則是一個例外，因為它能在水中、不會血清的培養(yǎng)基中或含有10%血清的培養(yǎng)基中生成復合物。如果您使用的是水或含有10%血清的培養(yǎng)基，則應保證它能適用于你特定的細胞體系。

復合物數(shù)量—對轉染細胞所用的轉染試劑/DNA復合物的量也應當進行優(yōu)化。如果用量太少，那么轉染DNA的表達就太弱;如果用量太多，則可能由于細胞毒性或其他作用反而降低蛋白的表達。最佳用量通常都必須進行實驗來確定。

這種影響用FuGENE? HD 轉染試劑進行實驗時尤其明顯。

而用FuGENE? 6轉染試劑進行轉染時則是一個例外，因為它在一個很寬的轉染復合物用量范圍內(nèi)都會得到很好的轉染結果。在很多情況下，F(xiàn)uGENE? 6 轉染試劑的這種特性使得不再需要對轉染劑量進行優(yōu)化過程。

所需要的轉染復合物用量與所用細胞的數(shù)量相關。轉染細胞越少，所需復合物就越少。

轉染復合物的加入—有兩種替換方法可用來漿轉染復合物加入轉染細胞：1. 將復合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基，或者2. 將轉染復合物先用培養(yǎng)基稀釋，然后進行培養(yǎng)基更換操作。第一種方法更簡便，而第二種方法則更因為避免了試劑在局部濃聚而產(chǎn)生毒性，所以會使結果的一致性更好。

對于諸如FuGENE? 6 轉染試劑和HD轉染試劑這類的溫和試劑而言，您可以先將轉染復合物加入培養(yǎng)容器，然后再加入用胰蛋白酶新鮮消化得到的細胞。

轉染培養(yǎng)基—轉染過程中所使用的培養(yǎng)基對轉染效率可能會有正面或負面的影響。甚至對于基礎培養(yǎng)基配方而言也是如此，尤其是在培養(yǎng)基中加入牛血清的情況下。胎牛血清的存在會使多種轉染試劑的轉染效率降低. 某些公司還提供可與轉染試劑配合使用的優(yōu)化無血清轉染培養(yǎng)基。而由羅氏應用科學部所提供的轉染試劑則無論是否存在血清都能有效轉染。

FuGENE? H D是獨一無二的能夠轉染保存在100%血清中腫瘤細胞的轉染試劑。

如果有抗生素(如，青霉素、鏈霉素、或兩性霉素B)存在的情況下培養(yǎng)細胞，則轉染有效性會降低至25%。因此，對于瞬時轉染，我們建議使用不加抗生素的培養(yǎng)基。

【時間進度】

一般提示：要確保最終結果的成功;建立一個合適的時間進度進行轉染實驗以保證您所需要的目標蛋白能得到最佳表達。

轉染的開始—在轉染前12小時，將細胞分種于培養(yǎng)板中。在轉染開始時，培養(yǎng)物應當有約50-80%匯聚，這樣就可以使它們在實驗結束時達到接近100%的匯聚。

如果在轉染中去掉血清，細胞可能會暫時停止生長。

細胞對轉染復合物的攝取通常在0.5-6小時的時間內(nèi)完成。在這段時間后，就不會再發(fā)現(xiàn)轉染效率有所增長。

培養(yǎng)基更換—某些轉染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉染必須在沒有胎牛血清存在的條件下進行，那么這一步驟就必不可少。至于可在血清存在的情況下使用的無毒性轉染試劑(如，F(xiàn)uGENE? 6 轉染試劑或FuGENE? HD 轉染試劑)時，如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達階段，就可以省略這一步。

如果將轉染復合物留在細胞中直到進行檢測，那么對有些細胞系而言轉染效率會有所提高，而另外一些細胞在轉染開始幾個小時之后其轉染效率就不會再有升高。

雖然在轉染步驟之后轉染試劑/DNA復合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中清除，但在此后的長期生長階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是必須的。如果轉染細胞需要生長3-7天，換培養(yǎng)基就尤其重要，這樣一來就使它們有時間達到最高的蛋白表達量。

時間測定—通常在轉染開始后的24-48小時間分析報告基因的表達。在這一時間段內(nèi)，報告基因產(chǎn)物的濃度逐漸增加;而這種增加取決于增強子的強度、在表達外源蛋白中所涉及的細胞反應，存活細胞的健康狀態(tài)，以及營養(yǎng)因素等。

如果您要收集蛋白進行純化，在轉染后等待3-7天就更為常見了。在收集蛋白時，培養(yǎng)基中加入COMPLETE完全蛋白酶抑制劑用來防止蛋白降解是一個很好的措施。